Zellbiologische Untersuchungen

Methodenübersicht

Absatz	Methode	Beschreibung
1.1	live/dead-Assay	FDA/EtBr tot/lebend-Färbung von tierischen Zellen mit Fluoreszenzfarbstoffen
1.2	WST-1® Assay	Messung der Verringerung der Aktivität intrazellulärer Dehydrogenasen
2.1	Colorimetrische und fluorimetrische Bestimmungen	Bestimmungen diverser Analyte (Protein, DNA etc.), für die ein kommerzieller Assay oder Nachweismethode existiert
2.2	Enzymaktivitätsmessungen	vorrangig kinetische Messung der Aktivität von bspw. AP, TRAP, Caspase 3, LDH
2.3	ELISA-Tests	hoch spezifische quantitative Bestimmungen mittels kommerzieller ELISA-Kits
2.4	Mikrobiologische Untersuchungsmethoden	Hemmhoftest zur Bestimmung der Aktivität von Antibiotika, Bestimmung bakterieller Zellzahlen bzw. bakterieller Schädigung mittels BACTiter-GloTM-Test (Promega)
2.5	Immunhistochemie	hoch spezifische Anfärbung zellulärer Komponenten mittels Antikörper
2.6	Proteinanalytik	SDS-PAGE, Westernblot
2.7	DNA/RNA-Analytik	PCR, RT-PCR, Nukleinsäureelektrophoresen

1. Cytotoxizitätstests zur Prüfung von Biomaterialien in vitro

1.1. Anfärbung von Zellen in einem live/dead-Assay (Fluoresceindiacetat/Ethidiumbromid)
Beispiel: Direktbesiedelung von Biomaterialien mit tierischen Zellen (permanente Zellinien: 3T3, CHO-9, MC3T3-E1), Kultur über 1 bzw. 4 Tage, jeweils Auswertung der Gesamtzellzahl bzw. des Anteils toter Zellen fluoreszenzmikroskopisch (Bilddokumentation über CCD-Kamera, softwaregestützte Bildauswertung)

1.2. WST-1^®-Assay (Roche)
Beispiel: Zu untersuchende Materialien werden mit komplettem Zellkulturmedium einer für die Anwendung relevanten Zelllinie 24 h bei 37 °C eluiert (ISO 10993-5: 1 ml Medium/0,2 g Material). Die Eluate (oder auch Verdünnungen davon) wirken anschließend 24 h auf die gewählten, vorkultivierten Zellen ein (Positivkontrolle: Zellkulturmedium statt Eluat). Danach wird das Eluat gegen Medium mit WST-1^TM-Reagenz ausgetauscht und weiterkultiviert, bis die Positivkontrolle einen Extinktionswert zwischen 0,2 und 0,5 aufweist. Der WST-1^TM-Umsatz durch intrazelluläre Enzyme wird anschließend absorptionsphotometrisch gemessen (Negativkontrolle: zellfreier Ansatz). Die Verringerung des Umsatzes ist ein Maß für die Schädigung der Zellen bezogen auf die unbeeinflusste Positivkontrolle. Ausgewiesen wird der relativen Aktivitätswert, dessen Skalierung Positiv- und Negativkontrolle in jedem Test mit 1,0 bzw. 0 definieren.

2. Biochemische Untersuchungen

2.1. Colorimetrische und fluorimetrische Bestimmungen
Auf der Basis colorimetrischer und fluorimetrischer Bestimmungsmethoden erfolgen Konzentrationsbestimmungen von Protein, DNA, Antibiotika, Wirkstoffen, sowie weiteren organischen und anorganischen Analyten.

2.2. Enzymaktivitätsmessungen
Die Nutzung des Multiwellplatten-Photometers Genios Pro (Tecan Deutschland) ermöglicht die Messung enzymatischer Reaktionen über die Abnahme von Substraten oder die Bildung von Produkten, sofern diese über charakteristische Absorption, Fluoreszenz oder Lumineszenz erfasst werden können. Bevorzugt erfolgt eine Messung der Kinetik. Praktische Erfahrungen existieren beispielsweise bei der Messung

• der Alkalischen Phosphatase (AP), z. B. als Marker der osteogenen Differenzierung von Osteoblasten oder MC3T3-E1-Zellen: Messung der AP-Aktivität aus Zell-Lysaten (daneben Färbung AP-positiver Zellen)
• der Tartrat-resistenten saueren Phosphatase (TRAP), z. B. als Marker der Differenzierung von Osteoklasten
• der Caspase 3 als einem zentralen Enzym im Apoptosegeschehen
• der Laktatdehydrogenase (LDH); freigesetzte LDH kann als Marker für Zellschädigungen dienen

2.3. ELISA-Tests
Kommerziell verfügbare ELISA-Tests werden zur quantitativen Bestimmung von Antibiotika, Wachstumsfaktoren wie BMP-2 u. a. eingesetzt.

2.4. Mikrobiologische Untersuchungsmethoden
Hemmhoftest zur Bestimmung der Aktivität verschiedener Antibiotika
Beispiel: In Stanzlöcher von Agarplatten, die Bacillus subtilis Sporen enthalten, werden Antibiotikum-enthaltende Proben gefüllt und bebrütet. Entstandene Hemmhöfe werden bildgebend dokumentiert, computergestützt vermessen und an Hand von mitgeführten Standards die Aktivitätswerte berechnet.

2.5. Immunhistochemie
Immunhistochemische Untersuchungen beschränken sich zur Zeit auf kultivierte Zellen, bei denen keine Einbettung oder Schnitt-Technik erforderlich sind.
Beispiel: Untersuchungen zum Adhäsionsverhalten tierischer Zellen auf Oberflächen mittels immunhistochemischer Vinculin-Färbung (kombiniert mit DAPI-Färbung).

2.6. Proteinanalytik
Zell-Lysate können mit gängiger Proteinanalytik (SDS-PAGE, Westernblot) auf das vorhandensein spezifischer Proteine untersucht, die Gele bzw. Blots dokumentiert und Bandenintensitäten mittels Software (GelPro, Media Cybernetics) quantifiziert werden

2.7. DNA/RNA-Analytik
DNA- und RNA-Analytik erfolgt qualitativ mittels PCR- bzw. RT-PCR-Methodik. Nukleinsäuren werden mittels Agarose-Gelelektrophorese getrennt und nach Anfärbung mit Ethidiumbromid dokumentiert (UV-System von Intas, Göttingen) und hinsichtlich Größe bzw. Bandenintensität mittels Software (GelPro, Media Cybernetics) analysiert.

3. Gerätetechnische Ausstattung

Zellkultur: Laminarbox, CO₂-Brutschrank, Autoklaven,
Mikroskopie: Axiovert 25 (Zeiss, Jena), Axiotech (Zeiss, Jena),
Bilderfassung am Mikroskop: MP 5000 (Intas, Göttingen),
Protein- und Nukleinsäure-Elektrophoresen,
Bilderfassung und Gelauswertung (Intas, Göttingen),
Mastercycler ep S (eppendorf),
Multiplattenphotometer Genios Pro (Tecan Deutschland),
Washer Columbus Pro (Tecan Deutschland),
Zentrifugen

Trademarks
WST-1^® ist die geschützte Handelsmarke von Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Deutschland
BACTiter-Glo^TM ist die geschützte Handelsmarke von Promega GmbH, Mannheim, Deutschland

Ansprechpartner:
Dr. Jürgen Weisser   Tel.: 03641-282556     mail